雄关漫道真如铁，而今迈步从头越

陈松

一、承担工作

我是本项目的负责人，所以在项目的实施过程中，主要由我来承担项目的进度安排，和导师的沟通、协调项目成员工作以及项目的具体实施。我每次都会提前和导师商量，安排好近期的大致的工作框架，具体的工作细节由我来细化，然后写出工作的protocol，估计完成所需要的时间，然后与项目组成员协调时间安排，争取大家都能够有机会动手实验。当遇到问题时，我会首先去查阅文献，与项目组成员一起交流，力争寻找到最佳的解决方案。

二、体会收获

还记得填写“上海市创新项目”的申请表的那一天，自己怀着无比激动的心情，憧憬着成果发布的那一刻。转眼间2年时间过去了，我也即将离开上海交大。在这最后的时间，我也希望能够给这个项目画上圆满的句号，给支持创新项目的各位领导和老师一个满意的答复。

就如同人生总是充满惊奇一样，在项目实施的过程中出现了许多意想不到的结果，当然这些绝大部分是属于负面的。面对这些意外，我告诉自己我能做的就是寻找解决问题的方法，实在没有方法，也要创造出方法。以下简述实验的过程及遇到的问题，总结经验教训。

1、在项目实施的非常顺利的时刻，出现了蛋白变复性之后不溶解的状况。难道是变复性方法不正确？于是我们查找了许多相关资料，尝试了各种改进条件，加入甘油，改变盐酸胍、尿素的浓度，但是最终的结果实在不理想。于是我们在此遇到了瓶颈，没有表达的蛋白，难以进行后续的动物体内外功能研究。最后发现原来在我们所使用的表达质粒带有信号肽，以至于表达的蛋白质溶解性降低，始终产生沉淀。于是我们决定从PCR开始，重新构建载体。

这个经历教会我：拿到的实验材料都需要经过严格的check，考察其细致的背景。并不是所有的相近的材料都可以用。文章上都要表明所用仪器、试剂的来源和公司，更何况是人为做出来的呢？实验的细致严谨是必须遵从的。

2、构建载体过程，由于没有相关的经历，所以对这些都十分陌生，很想找个人来帮忙。导师为了锻炼我们，提高我们解决问题的能力，所以只是给我们了相关的提示，给了若干个网站，让我们自己去解决。

这个经历教会我：授人以鱼，不如授人以渔。我在查找相关材料的过程中，也对ＰＣＲ的条件设置等后续的工作有了预先的了解，做到了心中有数，对整体的宏观把握更加的准确。同时带着自己需要解决的问题，自己查找相关文献，印象更加深刻，因为我知道了其中的原理。

3、在后续的PCR、酶切、连接等过程中，由于导师相当繁忙，所以我们基本上是自己摸索，根据实验室已有的protocol、文献、以及公司的guide来操作。但是万万没有想到的是这些东西上面只是粗略的步骤，细节的东西我们居然都没有考虑。比如做酶切、PCR等，操作都很简单，但需要注意的是要在冰上加样，这点是所有的东西都不会明明白白写在纸上的，是需要经验和别人的传授的。

这个经历教会我：对照着protocol，你未必能够把别人做过的实验完整的重复（当然排除他人数据造假的情况下）。其中的细节是关键，所以做研究不要怕和别人交流，和他人的交流会增加你知识的广度，或许不经意间还会获得灵感。

4、测序的结果老是出现问题。测序或者是测不出来，或者是非单克隆。整个测序的过程整的我够呛，换了N家公司，各种尝试都试过了，浓缩提质粒、划线重摇菌。但是结果都是无功而返。最后的打击来自于我偶然的发现。在查询文献的过程中，突然发现，原来我们的蛋白原核表达根本不合适——该蛋白需要翻译后修饰。至少需要用酵母甚至哺乳动物细胞来表达。原来这一切的一切，错误全在当初。

这个经历教会我：文献是前人经验的总结，当然存在不正确的地方，需要用怀疑的眼光去看待，但是还是值得借鉴的。前期的文献调研工作相当重要，可以正确了解自己课题的定位，需要研究的对象以及研究的方法，而不至于出现本身课题的缺陷，保证课题开展的顺利。实验的规划需要完整，而不是碰到一个问题解决一个问题就够的，需要有全局的观点。

在这个整个过程中，我学会了很多技术上的东西，包括分子克隆中的引物设计、PCR、酶切、连接、凝胶电泳、割胶回收、质粒扩增和抽提、感受态细胞制备、感受态细胞转化、配置培养基、铺平板、筛选克隆、从小鼠腿骨获取中骨髓细胞、抽提RNA等等，也包括蛋白表达纯化中的诱导表达、超声破碎、离心获取包涵体、变性、复性获得有活性的蛋白、凝胶柱纯化等等。

当然在平时实验的间隙，我也会帮助师兄师姐们做一些小操作，不仅仅局限在本课题所包含的范围之内，包括组织切片、染色、免疫组化、动物模型、药效学研究、流式细胞仪、原代细胞培养、细胞传代、集落形成实验、电转质粒、动物饲养、眼眶取血、外周血细胞计数等等。

技术上的学习方便了我看文献，能够直观形象的理解文献中提及的操作以及方法，更加容易理解文献。更重要的是，我在着整个经历中，更加深刻的明白了在社会中处理事情的方法，更加懂得了人生的真谛。

另外，我对科研也有了更加深入的了解，科研需要综合素质，需要扎实的基础知识，如果不够，就需要看大量的文献来弥补；科研需要细心、耐心和恒心，缺少任何一项都不是一个优秀的科研工作者；科研需要有全面的视角，要对所选课题相关报道实时关注，对其他领域的技术和方法要有“移植”的思想。

实验的另一个重要方面是需要注意安全。在我们这个领域，用到的很多试剂是具有毒性的，因此时刻注意安全防护，既是对自己的负责，也是对他人的负责。所以应该时刻谨记安全二字。

在整个实验的过程中，团队协作体现了重要性。由于上课的原因，无法有整块的时间用来做实验，于是我们便协调安排，将实验穿插在成员的课余时间，是整个实验得以顺利推进。

正如上述的描述，我从这个项目获得了如此多的东西，也将成为我今后继续在科研、学习和工作中奋斗的宝贵经历和财富。